Mario

Mario debe rescatar a la princesa peach, y cuenta con las siguientes habilidades: Cuando coge un champiñón se transforma en Super Mario y cuando coge una flor de fuego, en Fire Mario.

Luigi

Luigi, al igual que su hermano Mario, se encarga de rescatar a la Princesa. En este caso, aparece como segundo personaje, seleccionable para el segundo mando.

Peach

es secuestrada por Bowser, pero solicita la ayuda de Mario para que la rescate de su enemigo. Usa un vestido rosa y una corona sobre su cabello pelirrojo, el cual en versiones posteriores sería cambiado a rubio

Toad

Es un habitante y guardián del Reino Champiñón. Aparece al final de los 7 primeros castillos, mostrando la conocida frase: ¡Gracias Mario! Pero nuestra princesa está en otro castillo.

Bowser

Una tortuga antropomorfa más grande que un humano, quien invade el Reino Champiñón para apoderarse de él. El Rey Koopa aparece al final del cuarto nivel de cada mundo del juego.

Goomba

Los primeros enemigos en aparecer. Son unas setas de color café. Son los enemigos más fáciles de matar.

Lakitu

También del ejército Koopa, su característica principal es arrojar pequeñas tortugas con caparazón de pinchos, llamados Spiny.

Piranha Plant

Enemigo que se parece a una trampa para moscas y que emerge de las tuberías, y es de color verde. Suele ascender y descender periódicamente.